古斯塔夫·罗伯特·基尔霍夫1824年3月12日出生于普鲁士柯尼斯堡（今俄罗斯加里宁格勒），父亲是一名律师。1847年在柯尼斯堡大学获物理学博士学位，先后在布雷斯劳大学、海德堡大学、柏林大学任物理学教授。

1845年，还是学生的基尔霍夫就提出了电路分析的两条基本定律：基尔霍夫电流定律（节点电流守恒）和基尔霍夫电压定律（回路电压守恒）。这两个定律加上欧姆定律构成了电路分析的完整基础，至今仍是电气工程教育的核心内容。

1854年基尔霍夫到海德堡大学任教，与化学家罗伯特·本生开始了著名的合作。他们在研究金属盐在本生灯火焰中的发光现象时发现，每种元素都有独特的光谱线，可以像指纹一样识别元素。1859年他们发明了光谱分析仪，并在此后几年用这一方法发现了铯(1860年)和铷(1861年)两种新元素。光谱分析法开创了天体化学的新纪元——人类首次可以通过分析星光确定遥远恒星的化学成分。

同年（1859年），基尔霍夫提出了热辐射的基尔霍夫定律：在热平衡状态下，任何物体的发射率等于其吸收率。他进一步引入了黑体概念——完全吸收入射辐射的理想物体，并证明黑体辐射谱仅取决于温度，与材料无关。这一定律是理解热辐射的关键，直接引导了普朗克1900年提出量子假说解决黑体辐射问题，标志着量子论的诞生。

基尔霍夫还在弹性力学（基尔霍夫板理论）、光学衍射等领域有重要贡献。他的四卷本《数学物理讲义》是19世纪物理学的经典教材。由于长期残疾（1860年代后他必须靠拐杖或轮椅行动），1887年10月17日在柏林去世，享年63岁。